Иммуноферментный метод (постановка и учет реакции)

Одним из важнейших условий получения качественных препаратов является использование высокоактивных антивидовых иммуноглобулинов. Присутствие в лунках панели комплекса из антигена и связавшихся с ним антител удается определить с помощью маркированного ферментом (пероксидазой хрена) антигамма-глобулина, жадно соединяющегося с антителами.

Полученный усложненный конъюгат, освобожденный отмыванием от избытка несвязавшегося антигамма-глобулина, обнаруживают гистохимически по цветной реакции, образующейся после добавления к лункам 5-аминосалициловой кислоты с перекисью водорода. Во всех лунках, где антиген удерживает антитела и связанный с ними антигамма-глобулин, произойдет окрашивание в коричневый цвет. Из числа известных ферментов оксидазного действия для конъюгации с иммуноглобулином чаще всего используют щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. Применение ферментов оксидазного действия обусловлено возможностью их гистохимического выявления растворимыми субстратами с образованием аморфных преципитатов различного цвета. Конъюгация иммуноглобулинов с ферментами осуществляется с помощью бифуркационных агентов, самым распространенным из которых является 1 % раствор глютаральдегида. Выявление фермента осуществляется различными жидкими субстратами.

Подбор субстрата определяется ферментом, использованным для конъюгации иммуноглобулина:

• для проявления щелочной фосфатазы применяется 4-нитрофенилфос-фат (в концентрации 1 г/л в 10% диэтаноламиновом буфере);

• для пероксидазы хрена — 5-аминосалициловая кислота (8 мг на 10 мл дистиллированной воды) с добавлением перекиси водорода.

Постановка и учет реакции сводятся к следующему:

• в лунки панелей, сенсибилизированных известным антигеном, вносят по 0,3 мл испытуемой сыворотки в соответствующих разведениях, панели инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего лунки промывают забуференным физиологическим раствором для удаления непрореагировавшего с антигеном сывороточного глобулина;
• после взаимодействия фиксированного антигена с сывороточными антителами в лунки панелей вносят рабочее разведение конъюгированного с ферментом антивидового глобулина. Контакт между ингредиентами продолжается в течение 3 ч при комнатной температуре, после чего лунки панелей вновь промывают и вносят в них по 0,3 мл жидкого субстрата для выявления фермента;
• учет реакции — если исследуемая сыворотка содержит антитела, соответствующие известному фиксированному на панелях антигену и при этом образуется комплекс антиген — антитело, конъюгированный с ферментом иммуноглобулин связывается с этим комплексом.

В результате этого фермент, воздействуя на добавленный субстрат, вызывает изменение окраски субстрата, учитываемой визуально или фотометрически. Так, при проявлении оставшейся на иммунном комплексе щелочной фосфатазы нитрофенилфосфатом получают желтое окрашивание, а при проявлении пероксидазы хрена аминосалициловой кислотой — коричневое [Voller А. и др., 1977].

«Грипп и его профилактика», А.А. Смородинцев